技巧提示：頭像保存：在你喜歡的頭像上"右鍵->圖片另存為"，可以保存頭像。
這是一篇關(guān)于的文章，由個性8899頭像網(wǎng)為您精心整理發(fā)布，個性男生頭像欄目還有更多與相關(guān)的QQ頭像圖片供您挑選下載。
Nature綜述：精準(zhǔn)腫瘤學(xué)領(lǐng)域液體活檢的現(xiàn)狀和未來
藥明康德編譯整理
精準(zhǔn)腫瘤學(xué)的關(guān)鍵目標(biāo)是改善癌癥的診斷和治療。而對腫瘤樣*的一系列基因組和其它分子分析能夠幫助發(fā)現(xiàn)標(biāo)志物來幫助選擇療法，**預(yù)后，跟蹤腫瘤進(jìn)化，以及發(fā)現(xiàn)不同轉(zhuǎn)移*疾病的分子特征?；谙乱淮蚪M測序（NGS）的分子分析方法已經(jīng)在腫瘤分析方面得到應(yīng)用，而綜合DNA、RNA、蛋白質(zhì)和表觀遺傳特征的多參數(shù)綜合分析可能更準(zhǔn)確地描述腫瘤特征并且?guī)椭l(fā)現(xiàn)全新成藥靶點。
目前，精準(zhǔn)腫瘤學(xué)的焦點愈發(fā)轉(zhuǎn)向液體活檢，因為它不具侵襲*，而且可以在不同時間點重復(fù)進(jìn)行，從而幫助監(jiān)察疾病的進(jìn)展。如今，外周血液中可以被檢測的分析物（analyte）包括循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CT**）；循環(huán)無細(xì)胞DNA（cfDNA），在癌癥患者中它包含循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）。其它分析物物包括循環(huán)無細(xì)胞RNA（cfRNA）；細(xì)胞外囊泡（EVs），例如外泌體和腫瘤“教育”的血小板（TEPs）；蛋白質(zhì)和代謝產(chǎn)物。近*，《Nature Reviews Genetics》 對在精準(zhǔn)腫瘤領(lǐng)域液體活檢的現(xiàn)狀和未來進(jìn)行了盤點，在今天的這篇文章里，藥明康德的微信團(tuán)隊將與讀者分享這篇綜述的精彩內(nèi)容。
ctDNA作為生物標(biāo)志物的利與弊
ctDNA檢測是目前市場上最常見的液體活檢形式，它在具備巨大潛力的同時，在檢測**和臨床應(yīng)用的推廣方面也面對著一系列**。
ctDNA作為精準(zhǔn)腫瘤學(xué)生物標(biāo)志物的潛力
研究表明，ctDNA可能由凋亡細(xì)胞釋放，因此，它只代表了腫瘤細(xì)胞的一種特定亞群。盡管如此，ctDNA具有多個優(yōu)點：
1. 它能夠提供對腫瘤基因組的綜合描述，因為ctDNA從多個不同腫瘤區(qū)域或多個病灶處釋放，ctDNA分析可以發(fā)現(xiàn)組織活檢中無法發(fā)現(xiàn)的體細(xì)胞突變。
2. 深度測序可以發(fā)現(xiàn)腫瘤內(nèi)異質(zhì)*和只在部分細(xì)胞中出現(xiàn)的基因突變。這通常需要大量的CT**或者多次組織活檢才能獲得同樣水平的**。
3. ctDNA可以提供腫瘤大小的**，從而反映出疾病的發(fā)展?fàn)顟B(tài)和對療法的反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）和高級別漿液**巢癌（HGSOC）中ctDNA的突變等位基因頻率（VAF）與腫瘤體積呈線*關(guān)系。
4. ctDNA還具備**預(yù)后的價值。例如，在旨在治愈的手術(shù)或化療之后，ctDNA的出現(xiàn)是癌癥復(fù)發(fā)和不良預(yù)后的有力標(biāo)志。它**癌癥復(fù)發(fā)的能力在結(jié)腸癌、*巢癌、肺癌和*腺癌患者中都得到了驗證。
5. ctDNA分析能夠發(fā)現(xiàn)腫瘤抗*的標(biāo)志物，例如，在接受抗EGFR療法的結(jié)直腸癌患者中出現(xiàn)的KRAS突變，以及在*腺癌患者中的PIK3CA、MED1、或EGFR上VAFs的升高。
這些優(yōu)點讓ctDNA成為精準(zhǔn)腫瘤學(xué)應(yīng)用方面前景看好的分析物。然而ctDNA檢測也需要克服血漿中ctDNA水平過低，細(xì)胞衰老帶來基因變異的影響等**。
▲組織活檢與ctDNA檢測特點對比（圖片來源：參考資料[1]）
血漿中低水平ctDNA帶來的**
在血漿cfDNA中檢測到基因突變的能力與腫瘤負(fù)擔(dān)有對應(yīng)的關(guān)系。但是在不同患者身上的ctDNA水平可能相差很大，雖然他們患上同樣類型的癌癥。即使是在轉(zhuǎn)移*癌癥患者中，也有很大一部分患者血漿中ctDNA的比例異常的少。這清楚地表明，除了腫瘤負(fù)擔(dān)以外，還有其它生物因素影響腫瘤DNA的釋放。
據(jù)估算，1毫升血漿中含有大約1500個基因組當(dāng)量（GE）的DN**段，通常一次10毫升*血可以從血樣中獲得4毫升血漿，意味著能夠獲得6000 GE的DN**段。在VAF為0.1%的情況下，在這6000 GE的DN**段中，平均只有6個DNA分子攜帶著想要檢測到的基因突變，而且隨機(jī)取樣可能會影響這一數(shù)值。因此，可*、準(zhǔn)確并且可重復(fù)地檢測到這些基因突變是一個嚴(yán)峻的**。
檢測低水平ctDNA的方法
如果增加血樣體積，可以檢測到的分子數(shù)目自然會顯著上升，但是多*血的辦法通常在晚期癌癥患者中無法實現(xiàn)。另外一種克服攜帶基因突變的分子數(shù)目過少的方法是同時檢測多種基因突變，**確定一個基因突變數(shù)目的最低閾值來決定血漿樣*是否為腫瘤陽*。例如，有的液體活檢可以同時檢驗患者是否攜帶18種單核苷酸位點變異（SNV），如果檢測到的SNV數(shù)目超過2個，則將ctDNA樣*定義為腫瘤陽*。
近年來ctDNA檢測技術(shù)的**主要聚焦于增強(qiáng)測序技術(shù)的分析敏感度。測序技術(shù)的敏感度會受到測序準(zhǔn)確*和測序深度的影響。通過使用分子條形碼標(biāo)記被測序的DN**段，可以提高測序的準(zhǔn)確*，從而提高發(fā)現(xiàn)基因突變的幾率。
另一種提高敏感度的嘗試是富集特定長度的ctDN**段。有研究表明ctDNA 片段（132-145個堿基對）通常比健康細(xì)胞釋放的cfDN**段（~166堿基對）小。因此，富集特定大小的DN**段進(jìn)行測序可能提高發(fā)現(xiàn)基因突變的敏感度。
▲影響循環(huán)無細(xì)胞DNA檢測敏感度的因素（圖片來源：參考資料[1]）
細(xì)胞衰老對ctDNA檢測的限制
雖然這些技術(shù)的進(jìn)步能夠改善發(fā)現(xiàn)低VAF基因突變的能力，但是衰老細(xì)胞積累的體細(xì)胞突變也會對ctDNA的實用*添加限制。其中一個重要的*擾因素是良*體細(xì)胞基因突變隨著細(xì)胞衰老而增加。在***細(xì)胞中出現(xiàn)的良*基因突變會隨著細(xì)胞增殖傳給下一代，有的時候在腫瘤驅(qū)動基因中出現(xiàn)的基因突變會導(dǎo)致攜帶這些突變的*細(xì)胞增殖速度更快，這可能被誤認(rèn)為腫瘤增生。因此，在腫瘤驅(qū)動基因中發(fā)現(xiàn)基因突變并不等同于發(fā)現(xiàn)癌癥。
ctDNA檢測的分析效度和臨床有效*仍需確認(rèn)
在臨床護(hù)理中采納腫瘤生物標(biāo)志物檢測的原則有三條：1. 分析效度（analytical validity），指的是檢測的準(zhǔn)確*、可**和可重復(fù)*；2. 臨床有效*（clinical validity），指的是檢測能夠把患者分為不同群體，而且這些群體會有不同臨床后果的能力；3. 臨床實用*（clinical utility），指的是接受檢測的患者的臨床后果與未接受檢測的患者相比，是否有所改善。
目前，市場上的ctDNA 檢測的結(jié)果一致*和臨床有效*還未得到完全確認(rèn)。有研究使用兩種不同的ctDNA檢測方法對同一批樣*進(jìn)行檢測，試驗結(jié)果表明，在34個接受檢測的樣*中，只有9個樣*在兩種ctDNA檢測中給出了完全一致的結(jié)果。這種數(shù)據(jù)讓人對這些檢測的分析效度和臨床有效*產(chǎn)生疑慮。目前，業(yè)界需要進(jìn)行多中心研究，使用足夠大的患者群來確認(rèn)ctDNA檢測的分析效度和臨床有效*。
而且，檢測的標(biāo)準(zhǔn)*作程序和指導(dǎo)需要得到統(tǒng)一。歐洲標(biāo)準(zhǔn)化委員會（CEN）已經(jīng)發(fā)布了處理和紀(jì)錄用于ctDNA分析的血樣的標(biāo)準(zhǔn)程序。其它國際組織也在致力于將液體活檢的流程標(biāo)準(zhǔn)化。如果想將基于NGS的液體活檢在臨床中廣泛推廣，它們必需接受完備的檢驗并且通過基于確認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)的質(zhì)量檢測。
新興的液體活檢分析方法
以精準(zhǔn)腫瘤學(xué)的需求來看，現(xiàn)有的液體活檢技術(shù)還存在很多不足。但通過擴(kuò)大**獲取與檢測的范圍，我們有望實現(xiàn)液體活檢技術(shù)的真正潛力。在這一段中，我們也將介紹目前新興的一些液體活檢方法。
1. 組織與癌癥特異的DNA甲基化模式分析
在表觀遺傳學(xué)中，CpG的甲基化是基因表達(dá)和組織分化的重要調(diào)控方式。近年來，隨著人們對組織特異甲基化組學(xué)的了解不斷加深，通過分析甲基化的模式，我們可以推斷出cfDNA的組織來源，檢測癌癥。由于在癌癥發(fā)病初期，DNA就會出現(xiàn)甲基化修飾的變化，該技術(shù)有望在早期就協(xié)助醫(yī)生做出癌癥診斷。這一理念已經(jīng)在實驗中得到了驗證——2017年的兩篇論文表明，我們有望在*腺癌和*巢癌得到臨床確診的2年前，就在外周血液中檢測出腫瘤特異的甲基化變化。但這一技術(shù)目前也存在著瓶頸，主要難點在于獲取足夠數(shù)量的循環(huán)腫瘤細(xì)胞，以及對于單細(xì)胞甲基化模式的分析。
2. 核小體位置分析
血液中cfDNA的主要形式是受單個核小體保護(hù)（mononucleosomal protected）的DNA。和甲基化模式類似，來自不同細(xì)胞的cfDNA，其核小體所處的位置也有所不同。因此通過對這些核小體位置的分析，我們也能推導(dǎo)出cfDNA的來源。
3. miRNA分析
在生物學(xué)研究中，循環(huán)RNA在RNA-seq，qPCR，以及microarray等方面有著多樣的應(yīng)用。在諸多RNA內(nèi)，miRNA由于其在血漿或血清中的穩(wěn)定*得到了廣泛的關(guān)注，也有不少人期望能將其**成有用的診斷工具。舉例來講，有些科學(xué)家希望能使用低劑量計算機(jī)斷層掃描（low-dose computed tomography ，LDCT）技術(shù)，在高風(fēng)險的個體中對肺癌進(jìn)行早期檢測。而miRNA的評估有望減少LDCT技術(shù)較高的假陽*率。一些研究表明，miRNA與LDCT技術(shù)的結(jié)合，能將后者的假陽*率減少5倍！
▲不同液體活檢分析方法面對的**和潛在解決方法（圖片來源：參考資料[1]）
4. 分析細(xì)胞外囊泡的轉(zhuǎn)錄組和基因組
細(xì)胞外囊泡是核酸與蛋白質(zhì)的載體，在細(xì)胞與細(xì)胞，乃至器官與器官間的交流中起到了重要作用。從運輸能力上看，細(xì)胞外囊泡最多能運載近100個蛋白質(zhì)和約10kb長的核酸。在核酸方面，miRNA大約占了40.4%，piwi-互作RNA占了約40%，剩下的則是假基因（pseudo genes），lncRNA，tRNA，以及mRNA。這些RNA分子中的**有望用于確認(rèn)癌癥起源，做出早期診斷。除了核酸分子外，細(xì)胞外囊泡上的一些粘附分子（如整合素）也能用于推斷器官特異的癌癥轉(zhuǎn)移。
值得一提的是，外泌體（exosome）可以由活*癌細(xì)胞直接分泌。與ctDNA進(jìn)行配合，可以從多個角度展示腫瘤的生物學(xué)特征，做出更準(zhǔn)確的診斷。當(dāng)然，健康組織也會分泌大量外泌體，其中的遺傳物質(zhì)也會帶有變異。因此在臨床應(yīng)用上，我們還需要更好地對外泌體的行動進(jìn)行追蹤。
5. 經(jīng)過腫瘤“教育”的血小板
腫瘤細(xì)胞有時會將生物分子轉(zhuǎn)移到血小板上，這個過程也被形象地稱為“教育血小板”。有趣的是，這些**可以被用于區(qū)分癌癥患者。在一項研究中，科學(xué)家們收集了228個癌癥樣*，而對于這些經(jīng)過腫瘤“教育”的血小板進(jìn)行RNA-seq，科學(xué)家們可以將局部和轉(zhuǎn)移癌癥患者與健康人區(qū)分開來，準(zhǔn)確度達(dá)84%-96%。區(qū)分腫瘤來源的準(zhǔn)確度也達(dá)到了71%。這是因為不同的癌癥類型，會把不同的分子帶給血小板。當(dāng)然，這一技術(shù)目前還停留在較初步的階段。為了讓它得到更好的應(yīng)用，我們還需要了解腫瘤“教育”血小板的具體過程。
6. 蛋白質(zhì)分析
細(xì)胞的正常運作離不開蛋白質(zhì)，而許多疾病的根源正是蛋白質(zhì)的突變。然而除了PSA（前列腺特異抗原）外，目前臨床上我們能使用的蛋白標(biāo)志物少之又少，且大多無法區(qū)分其來自哪些組織或癌癥。蛋白質(zhì)組學(xué)的蓬勃發(fā)展給了人們契機(jī)，讓我們建立了高質(zhì)量的蛋白關(guān)聯(lián)*圖譜。目前，我們已經(jīng)可以利用這些技術(shù)，明顯提高液體活檢在早期癌癥中的檢測率。
7. 代謝物分析
腫瘤的生長發(fā)育往往會影響到人體生理上的變化，尤其是全身的代謝狀況。對于腫瘤來說，它們能肆意改變自己的代謝通路，而血液中的代謝產(chǎn)物可能會成為有用的癌癥標(biāo)志物。目前比較為人熟知的一個案例是**AA，它能預(yù)示腫瘤發(fā)育早期對代謝調(diào)控的*擾——胰腺癌的發(fā)病早期，**AA水平會有所上升。而在非小細(xì)胞肺癌里，**AA的水平則會下降。這些結(jié)果表明代謝物的組成可能成為液體活檢的重要部分。
8. 活*循環(huán)腫瘤細(xì)胞分析
近年來，單細(xì)胞分析技術(shù)有了飛躍式的發(fā)展，這也讓科學(xué)家們得以更為詳細(xì)地分析循環(huán)腫瘤細(xì)胞內(nèi)的基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)、以及表觀遺傳組**。其中，來自活*循環(huán)腫瘤細(xì)胞的**對于評估癌癥轉(zhuǎn)移有著重要的作用。除此之外，這些細(xì)胞也能被用來建立患者特異的腫瘤模型。但首先，我們還需要解決不同癌癥種類中循環(huán)腫瘤細(xì)胞的豐度問題。比如非小細(xì)胞肺癌就很少會帶來循環(huán)腫瘤細(xì)胞。
液體活檢技術(shù)面臨的**
任何一項技術(shù)在剛剛邁入應(yīng)用之際，總是充滿了**，液體活檢也不例外。盡管有多種新興分析方法不斷涌現(xiàn)，但這一技術(shù)的發(fā)展前方依舊充滿**。
1.真正理解血漿成分
關(guān)于液體活檢最大的爭議之一，在于我們是否真正了解了血漿成分。舉例來講，過去人們認(rèn)為ctDNA主要來自凋亡的癌細(xì)胞，但最近對ctDNA的一些分析卻找到了一些和癌細(xì)胞增殖有關(guān)的變化，刷新了認(rèn)知。因此為了更好地理解細(xì)胞如何將DNA釋放到循環(huán)**中，我們還需要更深入地了解健康人與癌癥患者中，血漿的組分與各個組織之間是怎樣的一個關(guān)系。截止到目前，我們做的還非常不夠。
舉例來說，不少關(guān)于組織特異*的研究，其專注的只有少數(shù)集中細(xì)胞類型，探索血漿cfDNA來源的研究也寥寥無幾。這容易給分析帶來偏差——不少研究指出白血球是循環(huán)核酸的主要來源，占比范圍在42%-90%。然而最近的一項研究卻發(fā)現(xiàn)，幼紅細(xì)胞來源的DNA在健康人里，中位占比大概是30.1%，而這是先前人們從來沒有報道過的組織來源?？上攵煌姆治龇椒ǖ贸龅慕Y(jié)論究竟有多大的區(qū)別，這也反映了我們對于血漿cfDNA組成的無知。
2. 液體活檢與免疫腫瘤學(xué)
液體活檢與免疫腫瘤學(xué)的交織，是最近的研究熱點之一。當(dāng)循環(huán)腫瘤細(xì)胞離開原發(fā)腫瘤之后，就會暴露在免疫監(jiān)控之下。因此，它們也需要一定的免疫逃逸機(jī)制才能生存。目前我們已經(jīng)知道，這些循環(huán)腫瘤細(xì)胞有能力改變自己的MHC I呈遞、改變NK細(xì)胞配體表達(dá)、或是下調(diào)FAS/FASL的表達(dá)。理解這些變化，有助于免疫腫瘤學(xué)的發(fā)展。
通過對循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行液體活檢，還能帶來實際的應(yīng)用價值。最近，人們通過抗PD-L1抗體，發(fā)現(xiàn)在這些細(xì)胞上也有PD-L1的表達(dá)。這些**可以用于患者細(xì)分。
此外，我們還能通過分析ctDNA里的腫瘤突變負(fù)擔(dān)（TMB），了解**點***的潛在效果。這是因為TMB越高，產(chǎn)生新抗原的幾率就越高。一些研究也表明，TMB能用來找到哪些患者在免疫療法的治療后，在臨床上能有更好的預(yù)后。
▲綜合多種參數(shù)，從液體活檢樣*中發(fā)現(xiàn)癌癥（圖片來源：參考資料[1]）
3. 對多種參數(shù)的測量與整合
如果要給液體活檢展望一下未來，成*檢測最小殘留病灶可以說是一個目標(biāo)。最終，我們希望能在早期對癌癥進(jìn)行診斷。要實現(xiàn)這些目標(biāo)，有時我們只需要檢測一個指標(biāo)就夠了。最近，2017年藥明康德生命化學(xué)研究獎得主盧煜明教授領(lǐng)銜的一支團(tuán)隊發(fā)現(xiàn)，只要在外周血液里檢測Epstein–Barr病毒的DNA，就能篩選出早期的鼻咽癌患者。許多專家認(rèn)為這項研究堪稱是里程碑。
但更多的情況下，一個指標(biāo)是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。在涉及多個指標(biāo)的案例中，我們還需要考慮參數(shù)整合的問題。在最早的一些嘗試中，人們主要綜合的是ctDNA與蛋白標(biāo)志物。舉例來說，CA19-9、TIMP1、以及LRG1等蛋白標(biāo)志物，輔以對KRAS基因突變的檢測，能夠找到腫瘤可切除的前列腺癌患者，且檢測率要高于只使用ctDNA的方法。
最近，一種叫做CancerSEEK的早期癌癥檢測策略浮出水面。在一項招募了1005名志愿者，涉及8種常見癌癥類型的臨床研究中，蛋白質(zhì)與遺傳標(biāo)志物的組合，猜對癌種的中位正確率為70%。由于致癌基因突變未必具有組織特異*，想要區(qū)分癌癥的來源，還是要*對蛋白質(zhì)的分析。但這種技術(shù)容易帶來假陽*，且在早期癌癥的檢測中效果不佳。
盡管如此，研究人員們依舊指出，通過整合不同標(biāo)志物的分析結(jié)果，液體活檢的潛力看好。在前列腺癌與胰腺癌的診療上，我們已取得了一些可喜的進(jìn)展。
4. 機(jī)器學(xué)習(xí)遇上液體活檢
人們也意識到，綜合考量多種指標(biāo)需要較高的計算能力，而機(jī)器學(xué)習(xí)算法則有望自動發(fā)現(xiàn)和檢測癌癥特異的指標(biāo)，助力液體活檢。這可能涉及簡單的邏輯回歸，也可能涉及復(fù)雜的多層人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。
事實上，機(jī)器學(xué)習(xí)技術(shù)已經(jīng)在液體活檢中取得了一些成績。比如利用深度學(xué)習(xí)的方法，我們能以更高的靈敏度和特異*去探測循環(huán)腫瘤細(xì)胞；用基于神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的miRNA分析，我們可以區(qū)分健康女*和罹患*巢癌的女*，特異*達(dá)100%。
但目前利用機(jī)器學(xué)習(xí)算法的最大短板，在于**觀察數(shù)據(jù)的不足。該綜述指出，目前患者的樣*量一般在幾十到幾千之間，而按堿基的分辨率計算，單名患者就可能產(chǎn)生數(shù)百億的數(shù)據(jù)。在理想的情況下，設(shè)置機(jī)器學(xué)習(xí)算法時，前者應(yīng)比后者的數(shù)量來得更多。比如經(jīng)典的圖像處理AI，處理的樣*高達(dá)數(shù)百萬，而潛在的分析特征只有幾千，兩者的數(shù)量級之間有著明顯的差距。在數(shù)據(jù)不足的前提下，機(jī)器學(xué)習(xí)算法可能會出現(xiàn)過度擬合。它能很好地解釋訓(xùn)練數(shù)據(jù)，但無法用于新的數(shù)據(jù)。
結(jié)語和展望
液體活檢在腫瘤學(xué)方面的應(yīng)用*益增多。然而，我們需要對液體分析物的產(chǎn)生機(jī)理和水平動態(tài)進(jìn)行更深入的了解，同時需要確認(rèn)液體活檢的臨床有效*和臨床實用*，這樣才能進(jìn)一步推廣液體活檢的臨床應(yīng)用。
目前，大多數(shù)檢測都只聚焦于一種分析物，然而將血液中存在的多種分析物的數(shù)據(jù)綜合起來構(gòu)成的多參數(shù)檢測可能大幅度改善檢測的精確度和使用范圍。這些檢測技術(shù)的**需要使用創(chuàng)新統(tǒng)計工具，它們能夠使用**機(jī)器學(xué)習(xí)方法來整合從一個樣*中獲取的大量數(shù)據(jù)。
因此，未來的液體活檢研發(fā)將橫跨多個學(xué)科，包括基*生物學(xué)和生理學(xué)、分子生物學(xué)、檢測技術(shù)、統(tǒng)計學(xué)和機(jī)器學(xué)習(xí)。非常關(guān)鍵的一點是，只有當(dāng)液體活檢的臨床有效*和臨床實用*得到證明之后，這項技術(shù)才能發(fā)揮它全部的潛力，為基因組驅(qū)動的腫瘤學(xué)和癌癥患者的臨床**帶來重大影響。
